共焦点レーザー顕微鏡の原理とイメージ
共焦点レーザー顕微鏡とはレーザービームと共焦点ピンホールを用い、「共焦点方式」と呼ばれる方式で走査を行う顕微鏡のことである。光源から照射されるレーザーを、対物レンズを用いて集光点（ビームスポット）に絞り込み、それをガルバノスキャナーやニポーディスクを用いて試料面上で2次元走査することによって、試料からの反射や散乱光、蛍光を光検出器（ディテクター）で検出する。試料面上における焦点（集光点）は結像面においても焦点となる。この焦点部分だけを選択して検出することから「共焦点」と呼ばれている。
共焦点レーザー顕微鏡の原理
『レーザー顕微鏡とは？』でレーザー顕微鏡の概略図（図１）を示したが、ここでは共焦点レーザー顕微鏡の概念図を示し、共焦点レーザー顕微鏡の原理を解説する。
図1 レーザー顕微鏡の概略図
共焦点ピンホール
レーザー顕微鏡では3次元情報をイメージ化するのだが、図１の構成では3次元情報を得ることはできない。なぜなら実際の試料の集光点以外の場所で様々な現象が発生し、それが検出されてしまうからだ。そこで3次元情報を得るために、ピンホールを使って焦点面以外から返ってくる光を除去し、焦点面からの光だけを抜き出す。これが共焦点レーザー顕微鏡である。下図は強焦点ピンホールの概念図である。
図2 共焦点ピンホール
このピンホールによって、共焦点レーザー顕微鏡は2次元の顕微鏡ではなく、3次元の顕微鏡として利用できる。
共焦点レーザー顕微鏡の概念図
下図が共焦点レーザー顕微鏡の概略図である。共焦点レーザー顕微鏡が他の共焦点顕微鏡と比べて優れているところは、『レーザーの空間コヒーレンスが高いため、対物レンズで集光したときに試料に回折限界のスポットサイズまで簡単に絞り込むことができる点』である。
図3 共焦点レーザー顕微鏡の概念図
レーザー光源の後に最初のピンホールは、レーザー光に若干存在する空間的に汚い成分を取り除くためにある。これによって、対物レンズで試料上の1つの点だけに光を集光することができる。また、検出器の前のフィルターは、試料にから発生した『レーザー光の波長以外の光』を観測したいときに挿入する。
共焦点レーザー顕微鏡の3次元イメージング
ここでは、共焦点顕微鏡で取得した３次元イメージングの画像と、それを再構築した3次元モデルを紹介する。撮像した試料の詳しい情報はリンク先を参照してください。
3次元イメージを再構築する前
下図はHeLa細胞のチューブリンを染色して、蛍光を取得した例である。光軸方向を変えて、随時画像を取得している。実際の共焦点レーザー顕微鏡では図1を再構築し、3次元イメージングをする。
図1 共焦点顕微鏡の3次元イメージング
共焦点レーザー顕微鏡の3次元イメージ
下図は共焦点レーザー顕微鏡の3次元イメージである。この動画の詳細は動画をクリックした先にあるページでご確認下さい。
図2 共焦点レーザー顕微鏡の3次元イメージ
